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避免荧光串色的方法

    在用荧光显微镜对样品进行观察时,两种或两种以上荧光素之间,如果荧光发射峰很近,那么荧光光谱彼此会有部分重叠,检测到可能出现一种荧光素的信号扩散到另一荧光通道的情况。这种现象称为串色或荧光光谱交叉(crosstalk)。避免或排除光谱交叉干扰的方法通常有以下几种:
    1)使用几种荧光素时,尽量选择之间无光谱交叉的荧光素。
    2)降低标记荧光强度:样品的一种或几种荧光强度太高,有时会导致光谱交叉出现。采用降低标记物浓度、缩短标记时间及调整荧光素介质等方法可降低样品荧光强度。
    3)采用序列扫描方法:主要是指用不同波长激光轮流照射样品,同时在相应的荧光检测通道轮流采集,并显示每种荧光的共聚焦图像。对于双重荧光染色样品其具体操作过程时:首先只用一种激光激发相应的第一种荧光物质,在第一通道显示其荧光图像;再用另一种激光激发另一种荧光物质,在第二通道显示其荧光图像。相应的顺序扫描软件能够将两通道的不同荧光图像同时分通道显示并叠加合成,展示出两次荧光间空间定位关系。以此类推,用顺序扫描方法还可以采集三重或更多重荧光样品的图像。
    4)修改光谱检测的检测条件:在图像上出现比较弱的荧光交叉信号时,可通过改变仪器的检测条件来克服,常用的措施有:
    a.降低干扰荧光的激发强度以降低其发射荧光强度;
    b.减小被干扰通道的检测灵敏度;
    c.改变激发光波长和检测波长范围等。例如在荧光通道2的图像上看到来自通道1的较弱的荧光交叉信号,这时,在保证采集到各通道清晰图像的情况下,降低通道1的激发强度,减小通道2的光电倍增管效能以降低其采集的灵敏度,小范围内改变各通道的检测波长,可以消除来自通道1的荧光交叉信号。
    5)荧光光谱鉴别法:通常情况下,不同荧光物质的荧光光谱不会完全重叠,利用不同荧光光谱之间的差异,可以将来自两种荧光物质的荧光信号鉴别开来,得到各自的荧光图像。

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